Si chiama Crispr/Cas9: è una tecnologia nata da appena quattro anni e già diffusa nei laboratori di tutto il mondo. Una tecnica di editing genomico rivoluzionaria per precisione e abbassamento dei costi, che però, a quanto pare, ha anche qualche punto debole. Una potenziale falla del Crispr, infatti, è il cosiddetto off-targeting, ovvero la possibilità che la modifica di un gene vada a intaccare, in modo imprevedibile e indesiderato, altre zone del genoma. Abbiamo chiesto ad Alessandro Rosa, ricercatore della Sapienza Università di Roma, di aiutarci a capire qualcosa di più.
Cos’è l’off-targeting e quando si verifica?
“Per off-targeting si intende il fenomeno per cui una particolare Crispr/Cas9 messa a punto per modificare un particolare gene possa alterare anche altre regioni del genoma. Normalmente, la tecnica funziona utilizzando una sorta di ‘guida’ (fatta con Rna) che da una parte si lega all’enzima Cas9 (responsabile del taglio nel genoma) e dall’altra riconosce la sequenza bersaglio (il target). Statisticamente, però, l’Rna può legarsi anche a sequenze simili ma non identiche a quella che si vuole modificare – donde il nome di off-targeting”.
Quali sono i pericoli maggiori legati all’off-targeting in cellule umane?
“L’off-targeting potrebbe portare, nel peggiore dei casi, ad alterare i cosiddetti geni oncosoppressori, quelli che proteggono l’organismo dallo sviluppo di tumori bloccando la riproduzione incontrollata delle cellule. Se la Crispr/Cas9 disattivasse erroneamente uno di questi geni, per effetto dell’off-targeting, potrebbe aumentare la probabilità di sviluppare un tumore. D’altra parte, l’off-targeting potrebbe anche attivare i cosiddetti geni proto-oncogeni, quelli che aumentano la proliferazione cellulare e favoriscono la trasformazione delle cellule sane in cellule tumorali”.
Come si può affrontare il problema?
“L’off-targeting può essere monitorato, ma bisognerebbe sequenziare ogni volta l’intero genoma modificato, un procedimento molto costoso e complicato. Alternativamente, si potrebbero controllare solo le sequenze del genoma che, per la loro somiglianza con quella di interesse, vengono predette come potenziali bersagli. Questo però non esclude che altre regioni possano essere modificate. O ancora si potrebbe ridurre l’errore costruendo una guida a Rna su misura o persino due guide diverse con due Cas9 diverse, ognuna delle quali non riesce a tagliare singolarmente la sequenza di Dna ma può farlo solo in coppia con l’altra. Una sorta di ‘controllo incrociato’ per ridurre la possibilità di errore”.
Come si personalizzano le guide a Rna?
“Esistono dei programmi informatici che controllano se ci sono regioni del genoma esattamente identiche alla sequenza di interesse: in tal caso si deve cambiare la sequenza della guida a Rna. Se, invece, si conoscono regioni del genoma molto simili, ma non esattamente identiche, alla sequenza bersaglio, il programma informatico è in grado di calcolare le probabilità che la guida a Rna si leghi per sbaglio a ognuna di queste regioni. Ne risulta che, dopo aver applicato la Crispr/Cas9, si controllano solo le sequenze più probabili. In condizioni estreme, però, rimane obbligatorio sequenziare l’intero genoma”.
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